Gateway rendszerek

Bővebben az Invitrogen weboldalon

A Gateway® Technológia egy hatékony rendszer, amit azért fejlesztettek ki, hogy leegyszerűsítse a klónozást és megkönnyítse különböző expressziós rendszerek kipróbálását.

Első lépésként klónozza be a kívánt gént egy Gateway® entry vektorba. Az entry vektorba történő ligáláshoz többféle módszert is választhat (pl. TOPO®, restrikciós enzimes emésztés stb.), továbbá rendelkezésre áll egy szekvencia-validált open reading frame (ORF) adatbázis is. Ez az adatbázis olyan megvásárolható vektorokat tartalmaz, amelyekbe már beklónozták a gének ORF-jeit.

Az Invitrogen a Gateway® expressziós vektorok széles választékát kínálja Önnek. Az entry vektorból egy egyszerű reakcióval számos más expressziós vektorba (destination, vagy célvektor) vihetjük át expresszálni kívánt szekvenciánkat.

 Gateway® Rendszer

 

Kilenc indok, hogy miért használjon Gateway® technológiát:

1. Gyors
2. Nem szükségesek restrikciós enzimek
3. Nem kell gélből DNS tisztítani
4. Nincs szükség ligálásra
5. Fenntartja a reading framet
6. Nem szükséges újra szekvenálni
7. Maximalizálja a kompatibibilitást és rugalmasságot
8. Minimalizálja a tervezést
9. Kíváló eredmények

Hogyan működik?

A Gateway® rendszer a gén ligálásához az expressziós vektorba lambda fág alapú hely-specifikus rekombinációt használ restrikciós endonukleázok és ligázok helyett. A Gateway® technológia alapja a DNS rekombinációs szekvenciák (attL, attR, attB és attP), és az LR és BP Clonase II enzim keverékek, melyek véghezviszik a lambda rekombinációs reakciót.
A gén bevitele a célvektorba mindössze két lépés.

Lambda fág rekombinációja E. coliban

 

1. lépés: A gén klónozása Gateway® entry vektorba

Számos módja van annak, hogy bejuthassunk a Gateway® rendszerbe. Ilyen lehetőségek a Gateway® att helyeket tartalmazó TOPO® vektorok használata, PCR- vagy restrikciós-alapú klónozás, vagy egy olyan Ultimate ORF klón vásárlása, amely már Gateway® vektorban van.

TOPO TA Cloning vektorból:

Leggyorsabb módszer a Gateway® rendszerbe való bejutáshoz

pCR®8/GW/TOPO vektor segítségével a Taq polimerázzal felamplifikált PCR terméket 5 perc alatt beklónozhatjuk egy vektorba, s így egyszerűen bejuthatunk a Gateway® rendszerbe.
A vektor a TOPO® klónozóhelytől mindössze 55 bázisnyira primerkötő helyet tartalmaz, s így a PCR termék szekvenálásakor csak kevés vektor DNS szekvenciát kell leolvasnunk. A klónozó hely közelében EcoRI restrikciós hely található, így a ligált termék könnyen kivágható. A vektor a könnyű szelekció érdekében streptomycin rezisztencia gént is tartalmaz.

Directional TOPO Cloning vektorból:

Directional TOPO® Cloning rendszerrel nagy hatékonysággal, egy lépésben lehet tompavégű PCR termékeket irányítottan az entry vektorba klónozni. A primer tervezés könnyű és egyszerű. Az amplifikációhoz szükséges egy CACC szekvenciával módosított 5' primer, egy 3' primer és egy "proofreading" enzim. A ligáláshoz nincs szükség ligázra, post-PCR módosításokra, vagy restikciós enzimekre. A pENTR/D-TOPO® and pENTR/SD/D-TOPO® vektorok gyors és hatékony lehetőséget nyújtanak a PCR termékek irányított ligálásához és expressziójához.

PCR vagy restrikciós klónozó vektorból TOPO Cloning nélkül:

pDONR és a pENTR vektorokkal lehetőség van olyan PCR termékek klónozására melyek primerei attB szekvenciákat, vagy restrikciós hasítóhelyet tartalmaznak.

Készen vásárolt klónból:

Úgy is be lehet jutni a Gateway rendszerbe, ha egy használatra kész klónt vásárolunk a klón gyűjteményből. Az Ultimate ORF Clone Collection olyan jó minőségű és teljes szekvenciákat tartalmazó humán és egér open reading frameket tartalmaz, amelyeket már beklónoztak pENTR 221 Gateway entry vektorba. A Gateway célvektorokat a tudományos társadalom számos kutató csoportja alkalmazza sikerrel.

2. lépés: Az entry klónból, in vitro, a Gateway LR Clonase II enzim keverék segítségével egy lépésben, bármelyik Gateway® expressziós vektorba átvihetjük a vizsgálandó gént.

Az att helyek közötti rekombinációval a vizsgálandó gén és a célvektorban található ccdB (sejthalált okozó) gén kicserélődnek egymással. A vektorok különböző antibiotikum rezisztenciája, illetve a ccdB gén biztosítja, hogy csak a vizsgálandó gént tartalmazó célvektort tartalmazó telepek nőjenek ki.

Gateway LR rekombinációs reakció